各位老铁们好，相信很多人对浓缩胶凝固时间都不是特别的了解，因此呢，今天就来为大家分享下关于浓缩胶凝固时间以及分离胶太长浓缩胶太短的问题知识，还望可以帮助大家，解决大家的一些困惑，下面一起来看看吧！
本文目录
- 浓缩胶如果用错ph有什么影响
- WB实验中9%和11.5%的分离胶凝固时间是否不同
- western blot 浓缩胶配好后多久可以用
- SDS凝胶电泳时分离胶凝固后会不会收缩,液面下降
- SDS-PAGE蛋白电泳配胶不凝固
- 如何判断浓缩胶凝固
- 为什么已经凝固的分离胶加了浓缩胶后会出现缺损
一、浓缩胶如果用错ph有什么影响
1、粘接强度下降：如果ph值过高或过低，会导致胶水中的化学物质发生变化，影响其粘接 *** 能，使胶水的粘接强度下降。
2、乳化不充分：如果pH值过高或过低，会使胶水产生乳化不充分的情况，会导致液体不稳定，成分出现分层，影响到乳化后的 *** 能。
3、时间延长：如果ph值过低，会影响胶水的凝固速度，导致胶水凝固时间过长，对生产造成一定困扰。
二、WB实验中9%和11.5%的分离胶凝固时间是否不同
WB，蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，是根据抗原抗体的特异 *** 结合检测复杂样品中的某种蛋白的 *** 。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异 *** 和敏感 *** ，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定 *** 和半定量分析。
原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定 *** 检测目的蛋白时细胞样品的处理 *** ，其余的样品制备 *** 参阅相关文献。
2.弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
3.加入1X SDS样品缓冲液，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上 *** 作。
4.超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘 *** 。
1.玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
2.配 10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
3.当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4.配 4％的浓缩胶,加入 TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子 *** 浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
5.用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
6.在电泳槽的上、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS电泳缓冲液，上样。
7.连接电泳槽到电泳仪。上槽接负极,下槽接正极，通电起始电压70～ 80V，10min后100V，电泳2h或当溴酚蓝迁移至离底部1cm时，停止电泳。
1.将胶浸于转移缓冲液中平衡 10min。注意：若检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。
2.依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和 3-5秒钟。
3.装配转移三明治:海绵3层滤纸胶膜，3层滤纸海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记:胶放于负极面(黑色面)。
4.将转移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色面)，加转移缓冲液， *** 上电极，100V，1h(电流约为 0.3A)。
5.转膜结束后，切 *** 源，取出杂交膜。
1.用25ml TBS洗膜5min，室温，摇动。
2.置膜于25ml封闭缓冲液中1h,室温，摇动。
4.加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。
6.加入合适稀释度的碱 *** 磷酸酶(AP)或辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。
将 A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于 A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
三、western blot 浓缩胶配好后多久可以用
1、这个得看实验中TEMED和AP的量，质量如何，另外实验室温度也会有影响。
2、如果一切正常，也是室温的话，或温度稍高，有个20-30min是可以用了。
3、但是如果AP失效，TEMED不太好，或者实验室温度较低的话，这个时间就得延长。具体延长多少，需要根据分离胶凝固的时间作为参考进行判断。有的时候为了保险起见，有人会让胶聚合1个小时以后再使用。不过也需要担心过长时间放置可能会导致胶的水分蒸发，出现皱缩。
四、SDS凝胶电泳时分离胶凝固后会不会收缩,液面下降
1、SDS凝胶电泳时分离胶凝固后会不会收缩
2、DNA分子量大，就算是100bp，差不多是12K，分开很容易，条带比较单一。而蛋白相对来说就小了些，30到40K的蛋白，很常见，而且各蛋白间相差小。多半是大大小小的蛋白混合物。相差小。并且DNA结构简单，由四种碱基组成，同样100bp速度接近。而蛋白由20种AA组成，各蛋白组成差别大。所以DNA电泳，不用浓缩胶就可以跑得很好。没必要用浓缩胶。而蛋白电泳，本身的原因，再加上进入电泳孔的时间不同，如果不用浓缩胶，分跑得很宽而分不开。有了浓缩胶，会在进入分离胶时，让所有的蛋白在同一起跑线上，这一条线，很细很细。染料在浓缩胶中可以观察得到。
五、SDS-PAGE蛋白电泳配胶不凝固
1、3，配好胶后放在温箱里凝的快些，环境温度低会影响凝的速度。我在冬天会灌好胶后放在培养箱里，一般很快就凝了，可以提高效率，一天最多可以跑5次。
2、最后，经常出现浓缩胶凝但不成形，非常粘，这是因为C液（浓缩胶缓冲液）的pH值不对，重新配制C液
3、做了四年蛋白电泳实验，不凝是是最初发生的问题，基本按以上思路解决的，以后再没遇见过，但也不排除我能力范围之外的没想到的因素
六、如何判断浓缩胶凝固
1、浓缩胶凝固时间大约在40-60分钟，可观察到胶体与梳子分离，拔出梳子(或观察不到，但只要时间够了也可以拔出)，注意要竖直向上拔出，避免左右摆动 *** 凝胶。
2、20分钟后，确定浓缩胶已凝固，用双手的食指与拇指捏住梳子，平行往上拔出梳子，查看浓缩胶的梳齿是否整齐，将歪斜的胶齿用注射器针头拨齐。
七、为什么已经凝固的分离胶加了浓缩胶后会出现缺损
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选pH6.8的TR *** /HCL缓冲液，电极液选TR *** /甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率更大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白 *** 在移动界面附近，浓缩成一中间层。大大提高了电泳的灵敏度。
一般同工酶可选择7?5%～10%的胶(过氧化物酶和酯酶7?5%较合适，超氧化物歧化酶用10%，可溶 *** 蛋白可根据需要配制)。将配制好的凝胶液置真空干燥器中，抽气10Min，再加入TEMED15μl；混匀后用一细玻棒引流，沿无凹槽的玻板缓缓注入胶室中，注胶过程要防止气泡产生。胶液加到离凹槽3CM处为止，立即用注射器轻轻在胶溶液上面铺1CM高的水层，但不要扰乱丙烯酰胺胶面。待分离胶和水层之间出现清晰的界面时，表示聚合已完成。用注射器小心吸出上层覆盖水，按表5－1配制好浓缩胶，抽气后加入5μlTEMED，混合后加到分离胶上层， *** 预先选择好的样品梳，注意不要带入气泡。
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